Deneysel osteoartrit modelleri

Kondrosit kültürleri

İn vitro çalışmalar için kıkırdak dokusu seçerken birkaç önemli nokta dikkate alınmalıdır. Kondrositlerin matris bileşimi ve metabolik aktivitesi eklemler arasında değişir ve ikincisi aynı zamanda dokudaki kondrosit yerleşiminin derinliğine de bağlıdır. Bu veriler, farklı derinliklerdeki kıkırdak bölgelerinden izole edilmiş kondrosit alt popülasyonlarının incelendiği birkaç deneyde elde edilmiştir. Eklem kıkırdağının yüzeysel ve derin katmanlarında bulunan kültürlü kondrositler arasında bir dizi morfolojik ve biyokimyasal farklılık bulunmuştur. Yüzeysel hücreler seyrek, proteoglikan açısından fakir bir fibriler matris sentezlerken, daha derin hücreler fibriller ve proteoglikanlar açısından zengin bir matris üretir. Dahası, yüzeysel hücreler daha derin kondrositlere kıyasla nispeten daha fazla küçük agrege olmamış proteoglikan ve hyaluronik asit ve nispeten daha az agrekan ve keratan sülfat üretir. Farklı derinliklerdeki kıkırdak bölgelerinden izole edilmiş kondrositlerin metabolizmasının bir diğer önemli ayırt edici özelliği, ekzojen bir uyarana yanıt vermesidir. M. Aydelotte ve arkadaşlarına göre kıkırdağın yüzeysel bölgesinden alınan sığır kondrositleri, derin bölgeden alınan hücrelere göre IL-1'e karşı daha duyarlıydı.

Hücre davranışı ayrıca doku konumuna da bağlıdır. Aynı hayvandan alınan kaburga ve kulak kıkırdağından alınan kondrositler, fibroblast büyüme faktörü (FGF) ve TGF-beta gibi büyüme faktörlerine farklı tepki verir. FGF, kültüre edilmiş kaburgaya timidin, prolin ve lösin katılımını artırdı ancak kulak kondrositlerine artırmadı. TGF-beta, kaburga ve kulak kıkırdağı kondrositlerine timidin katılımını artırdı ancak kulak kondrositlerine timidin ve prolin katılımı üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Yüksek stres bölgelerinden alınan kıkırdak hücreleri, kıkırdak üzerinde düşük stres bölgelerinden alınanlardan farklıdır. Bu nedenle, menisküsle kaplı olmayan tibianın eklem yüzeyinin merkezi bölgesinden alınan olgun koyun diz eklemi kıkırdağının kondrositleri, in vivo en fazla yükü taşıyan, menisküsle kaplı bölgelerden alınan hücrelerden daha az agrekan ancak daha fazla dekorin sentezler. Yazarlar ayrıca eklemlerin sentetik işlevini incelerken aynı eklem bölgelerinden alınan kıkırdakların kullanılmasının önemini vurgulamaktadır.

Kondrositlerin metabolizması ve düzenleyici faktörlere tepkileri de önemli ölçüde donörün yaşına, iskelet gelişimine ve hücrelerin alındığı eklemlerin durumuna bağlıdır. İnsan kondrositlerinde yaşla birlikte proliferatif tepkide önemli bir azalma gözlenir. En büyük azalma 40-50 yaş ve 60 yaş üstü donörlerde gözlenir. Ayrıca, büyüme faktörlerine (örneğin FGF ve TGF-beta) karşı proliferatif tepkinin şiddeti yaşlanmayla birlikte azalır. Kondrosit proliferasyonunda niceliksel değişikliklere ek olarak, niteliksel değişiklikler de vardır. Genç donörlerden (10-20 yaş) alınan hücreler, TGF-beta'dan ziyade trombosit kaynaklı büyüme faktörüne (PDGF) daha iyi yanıt verirken, yetişkin donörlerden alınan hücrelerde bunun tersi gözlenir. Kondrositlerin sentetik işlevindeki ve büyüme faktörlerine yanıtlarındaki yaşa bağlı değişiklikleri açıklamak için çeşitli mekanizmalar kullanılır. Bunlar arasında yüzey hücre reseptörlerinin sayısı ve afinitesinde azalma, büyüme faktörleri ve sitokinlerin sentezinde ve biyoaktivitesinde değişiklikler ve reseptör sonrası sinyallerin modifikasyonu yer almaktadır.

Eklem patolojik durumu ayrıca kondrositlerin morfolojisini ve metabolik aktivitesini değiştirir. Bu nedenle, J. Kouri ve ark. (1996) osteoartrozlu kıkırdakta üç kondrosit alt popülasyonu tanımladılar. Kıkırdağın ortasının yüzeysel ve üst kısmındaki kondrositler kümeler oluşturur ve daha fazla miktarda proteoglikan ve kolajen sentezler. TGF-beta ve insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), kondrositler tarafından proteoglikanların sentezini uyarabilir ve IL-1 ve TNF-a'nın etkilerini kısmen nötralize edebilir. Osteoartrozdan etkilenen kıkırdak eksplantları ve osteoartrozlu bir hastanın kıkırdağından izole edilen kondrositler, sağlıklı kıkırdak kondrositlerine göre TGF-beta'nın uyarılmasına daha duyarlıdır. Bu farklılıklar büyük olasılıkla eklem kıkırdağının üst katmanlarındaki kondrositlerdeki fenotipik değişikliklerle ilişkilidir.

Bireysel kondrositlerin izolasyonu, ECM'nin proteolitik enzimlerle ardışık olarak işlenmesiyle elde edilir. ECM'den serbest bırakıldıktan sonra, izole edilen hücreler matris bileşenlerinin de novo sentezini incelemek için idealdir. Bazı yazarlar sadece klostridial kolajenaz kullanırken, diğerleri kıkırdağı tripsin, pronaz, DNaz ve/veya hiyalüronidaz ile önceden inkübe eder. İzole edilen hücre sayısı kullanılan enzimlere bağlıdır. Bu nedenle, sadece kolajenaz ile tedavi edildiğinde, 1 g dokudan 1,4-10 ^{6 kondrosit elde edilebilirken, pronaz, hiyalüronidaz ve kolajenaz kullanıldığında - 4,3-106.} Kolajenaz, agrekan, proteinler, IL-6 ve IL-8 ile tedavi edildiğinde, hücre kültüründe farklı enzimlerle ardışık olarak tedavi edilenden önemli ölçüde daha fazla miktarda kalır. İki hücre kültürü arasındaki bu farklılıklar için birkaç açıklama vardır:

• Hücre reseptörleri enzimler tarafından hasar görür veya inhibe edilir, TGF-beta taze izole edilmiş kondrositlerde DNA ve proteoglikan sentezini inhibe eder (1. gün), oysa monokatmanda kültürlenen kondrositlerde DNA ve proteoglikan sentezi (7 gün) TGF-beta tarafından uyarılır. Ancak, deneyin başlamasından önce bu membran bileşenlerinin yeniden ifade edilmesi için yeterli bir süre gereklidir.
• Ekzojen proteazlar integrin aracılı hücre-matris etkileşimini bozabilir. İntegrin ailesi kondrositlerin ECM moleküllerine bağlanmasını teşvik eder (Shakibaei M. ve diğerleri, 1997). Bu bozulma matris genlerinin ifadesini etkileyebilir.
• Matriks bileşenlerinin kalıntıları kondrositlerin sentetik işlevini düzenleyebilir. İntegrinler, ECM bozunmasının ürünlerini tanıyabilir ve böylece proteolitik enzimlerin etkisinden sonra doku onarımında önemli bir rol oynarlar. T. Larsson ve arkadaşları (1989), hücre kültürüne sağlam veya parçalanmış proteoglikanların eklenmesinin protein ve proteoglikanların sentezini uyardığını bildirmiştir. Ancak, yüksek seviyede hyaluronik asit, tavuk embriyosunun kondrositleri, domuzun olgun kondrositleri ve sıçan kondrosarkom hücrelerinin proteoglikan sentezinde sülfatların dahil edilmesinde önemli bir azalmaya neden olur. Dahası, hyaluronik asit, IL-1b, TNF-a, FGF varlığında bile hücrelerden proteoglikan salınımının bir inhibitörüdür ve bu, büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin ilk biyolojik aktivitesinin karşı tepkisini gösterir. Hyaluronik asidin etkisinin altında yatan kesin mekanizma henüz net değildir; Kondrositlerin sitozolün aktin filamentleriyle ilişkili hyaluronik asit için bir reseptör içerdiği bilinmektedir. Hyaluronik asidin reseptörüne bağlanması protein fosforilasyonunu uyarır. Bu nedenle, bu veriler hücre zarı reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla parçalanmış veya doğal matris protein molekülleri tarafından kondrosit metabolik fonksiyonunun modülasyonunu göstermektedir.
• Kondrositlerde matris protein sentezinin enzimler tarafından hızla uyarılması, kondrosit şeklindeki değişikliklerin ve/veya sitoskeletal yeniden organizasyonun bir sonucu olabilir.
• Bazı sitokinler (örneğin, IL-8) ve büyüme faktörleri (örneğin, IGF-1, TGF-β) ECM'de tutulur. En iyi bilinen örnek, dekorin tarafından TGF-β'nin bağlanmasıdır; bu, Çin hamster yumurtalık hücrelerinde hücre büyümesini indükleme yeteneğinin azalmasıyla sonuçlanır. Kıkırdaktaki dekorin içeriğinin yaşla birlikte arttığı bulgusu, yaşlanmayla birlikte TGF-β biyoyararlanımının azaldığını düşündürmektedir. Büyüme faktörleri ve sitokinler, kültür sırasında matris kalıntılarından salınabilir ve daha sonra kondrosit işlevini düzenleyebilir.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Kondrositlerin tek katmanlı kültürü

Kondrositlerin farklılaşmış fenotipi, öncelikle tip II kollajen ve dokuya özgü proteoglikanların sentezi ve düşük seviyede mitotik aktivite ile karakterize edilir. Tek tabaka halinde uzun süreli hücre kültürü ile ve ayrıca birkaç tekrarlanan hücre geçişinden sonra kondrositlerin küresel hatlarını kaybettikleri ve uzun, fibroblast benzeri bir şekil aldıklarına dair kanıtlar vardır. Bu tür fibroblastik metaplazi ile hücrelerin sentetik işlevi de değiştirilir ve tip II, IX ve XI kollajenlerinin sentezinde ilerleyici bir azalma ve tip I, III ve Y kollajenlerinin sentezinde bir artış ile karakterize edilir. Fonksiyonel agrekan nedeniyle küçük, agrege olmayan proteoglikanlar sentezlenir. Katepsin B ve L sentezi farklılaşmış hücrelerde son derece düşüktür, ancak farklılaşma kaybı sürecinde artar. Kollajenaz-1 farklılaşmış kondrositlerde ifade edilir; Uzun süreli kültürleme ile ekspresyonu azalırken, metalloproteazların doku inhibitörlerinin (TIMP'ler) üretimi artmaktadır.

Farklılaşmış kondrositler, monokatmandan süspanse kültüre transfer edildiğinde farklılaşmış fenotipin kolajenini yeniden ifade eder. Farklılaşma süreci muhtemelen hücre şekliyle ilgilidir. Bu özellik, otolog kondrositlerle defektli greftleri inceleyen araştırmacılar tarafından düzenli olarak kullanılır. Biyopsi materyalinden elde edilen az sayıda hücre, monokatman kültüründe çoğaltılabilir ve daha sonra nakilden önce üç boyutlu bir matrise yeniden sokulabilir. Agaroz kültürüne transfer edilen dediferansiye kondrositler tarafından belirli bir fenotipin yeniden ifadesi, TGF-β, ossein-hidroksiapatit kompleksi ve askorbik asit tarafından uyarılabilir.

Büyüme faktörleri ve sitokinlere yanıt olarak, kondrositler farklılaşma süreci sırasında modifiye edilir. Sitokinlere ve büyüme faktörlerine hücresel yanıt, farklılaşmamış ve farklılaşmış kondrositler arasında farklılık gösterir. IL-1 fibroblast proliferasyonunu uyarırken, farklılaşmamış kondrositlerin büyümesi IL-1 tarafından inhibe edilir. DNA sentezi, uzun ancak düzleşmemiş kondrositlerde IGF-1 tarafından uyarılır. Farklılaşmış kondrositlerde, IL-1beta ve TNF-a'nın prokolajenaz üretimi üzerindeki uyarıcı etkileri, farklılaşmamış kondrositlere göre daha belirgindir.

Kondrosit Kültürü

Sıvı bir ortamda veya doğal veya sentetik üç boyutlu bir matriste süspansiyon halinde kondrositlerin yetiştirilmesi kondrosit fenotipini stabilize eder. Hücreler küresel şekillerini korur ve dokuya özgü proteinleri sentezler. Kondrositlerin askıya alınmış kültürü genellikle yeni bir perisellüler matrisin oluşumunu incelemek için önerilir. Sentetik veya doğal emici polimerlerdeki kondrosit kültürleri, eklem kıkırdak dokusunun rejenerasyonunu uyarmak için kıkırdak defektlerine hücre implantasyonu için kullanılır. İmplante edilen hücreler için sentetik veya doğal ortam bir dizi gereksinimi karşılamalıdır:

• İmplantların hücre yapışması ve büyümesi için gözenekli bir yapıya sahip olması gerekir,
• ne polimerin kendisi ne de bozunma ürünleri canlı organizmaya yerleştirildiğinde iltihaplanmaya veya toksik reaksiyonlara neden olmamalıdır,
• Greft taşıyıcısı bitişik kıkırdak veya subkondral kemiğe bağlanma yeteneğine sahip olmalıdır,
• Doğal veya sentetik matrisin emme yeteneğine sahip olması, bozunmasının doku rejenerasyonu ile dengelenmesi gerekir,
• Kıkırdak onarımını kolaylaştırmak için, matrisin kimyasal yapısı ve gözenek mimarisi, hücre fenotipinin korunmasını ve içine yerleştirilen kondrositler tarafından dokuya özgü proteinlerin sentezlenmesini kolaylaştırmalıdır,
• İn vivo implantasyon sırasında sentetik veya doğal matrisin mekanik özelliklerinin incelenmesi gerekir.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Kondrositlerin sıvı fazda süspansiyonu

Kondrositlerin kültürlendiği plastik damarlara hücrelerin bağlanması, duvarlarının metilselüloz, agaroz, hidrojel (poli-2-hidroksietil metakrilat) veya bir kolajen-agaroz karışımı çözeltisi ile kaplanmasıyla önlenebilir. Bu koşullar altında, kondrositler kümeler oluşturur ve esas olarak agrekan ve dokuya özgü kolajenler (II, IX, XI tipleri) sentezler. Genellikle iki tip hücre bulunur. Merkezde bulunan hücreler küresel bir şekil korur ve histokimyasal ve ultrastrüktürel çalışmalarla doğrulanan iyi gelişmiş bir ECM ile çevrilidir. Çevrede, kondrositler diskoid ana hatlara sahiptir ve seyrek bir ECM ile çevrilidir; bu tür hücrelerin işlevsel özellikleri hakkında çok az şey bilinmektedir.

Süspansiyonda tutulan mikro taşıyıcılar üzerinde kondrosit yetiştirmek mümkündür; dekstran boncuklar (cytodex), kolajen kaplı dekstran boncuklar (cytodex III) ve tip I kolajenin gözeneksiz mikro küreleri (cellagen) mikro taşıyıcı olarak kullanılır. Bu kültür koşulları altında, kondrositler mikro taşıyıcının yüzeyine tutunur, küresel şekillerini korur ve matris benzeri bir malzeme üretir. Dahası, cellagen kullanımı kondrosit çoğalmasını ve normal fenotipin yeniden ifade edilmesini teşvik eder. Bu nedenle, cellagen mikro küreler üzerinde kondrosit yetiştirmek, nakilden önce hücre fenotipini geri kazandırmak için kullanılabilir.

^{Kondrosit süspansiyonunu sıvı bir ortamda kültürlemenin bir başka yöntemi, santrifüjleme ile elde edilen hücrelerden oluşan yoğun toplar (0,5-1 * 10 b} ) şeklinde kültürlemeleridir. Bu tür kondrositler, histolojik, immünohistokimyasal ve kantitatif yöntemlerle doğrulanan, büyük miktarda proteoglikan, kolajen tip II, ancak kolajen tip I içermeyen bir matris üretebilir.

Doğal ECM'de kondrositlerin süspansiyonu

Kondrositler üç boyutlu bir matris içerisinde süspansiyon halinde (yumuşak agar, agaroz, kollajen jel veya sünger, hyaluronik asit, fibrin yapıştırıcı, aljinat boncuklar) kültüre edilebilir.

Agarozda kültüre edilen kondrositler normal fenotiplerini korur ve tip II kollajen ve dokuya özgü agrekan agregatları sentezler. Agarozda kültüre alındığında, hücre tarafından sentezlenen proteoglikanlar 50 gün boyunca ortama salınır. Karşılaştırma için, tek katmanlı bir kültürde, hücresel faz, kültürün ilk 5-6 gününde zaten glikozaminoglikanlar ile aşırı doldurulur; ortamda kültüre alındığında, ilk 8-10 günde glikozaminoglikanların sentezi ve salınımı arttıktan sonra, zamana bağlı olarak azalırlar. Bununla birlikte, agarozda kültüre alındığında kondrositlerin davranışı in vivo'dan farklıdır. Agarozda, çok sayıda sentezlenen agrekan agregatı, in vivo'dan daha küçük moleküller ve daha az molekül içerir. TGF-β, eksplantta proteoglikan sentezini uyarır, ancak agarozda agrekan sentezini azaltır.

^{Aljinat, kahverengi deniz yosunundan elde edilen doğrusal bir polisakkarittir. Ca 2+} iyonları gibi iki değerlikli katyonların varlığında, bu polimer bir jel haline gelir. Aljinatta sıkışan her kondrosit, gözenekleri hiyalin kıkırdaktakilere benzeyen negatif yüklü polisakkaritlerden oluşan bir matrisle çevrilidir. Aljinat boncuklarındaki kondrositler tarafından oluşturulan matris, iki bölmeden oluşur - eklem kıkırdağının perisellüler ve bölgesel matrisine karşılık gelen ince bir hücre ilişkili matris tabakası ve doğal dokudaki interterritorial matrise eşdeğer daha uzak bir matris. Kültürün 30. gününde, hücrelerin ve bir aljinat boncuktaki iki bölmenin her birinin kapladığı göreceli ve mutlak hacim, doğal kıkırdaktakilerle neredeyse tamamen aynıdır. Yaklaşık 30 gün boyunca kondrositler küresel şekillerini korur ve hidrodinamik özellikleri eklem kıkırdağı matrisindeki agrekan moleküllerinin yanı sıra II, IX ve XI tip kolajen moleküllerine benzer olan agrekan üretir. Aynı zamanda, diğer süspansiyon kültürleri gibi, aljinat boncuklarının yüzeyinde, doğrudan ortama salınan ve ECM'ye dahil olmayan az miktarda tip I kolajen molekülü üreten yassı hücreler bulunur. Aljinat boncuklarında orta düzeyde kondrosit çoğalması gözlenir. Aljinat jelde 8 aylık kültürden sonra, olgun kondrositler metabolik aktivitelerini kaybetmez ve dokuya özgü tip II kolajen ve agrekan sentezlemeye devam eder.

H. Tanaka ve diğerleri (1984), aljinattaki çeşitli doğal moleküllerin difüzyon özelliklerini araştırdı ve 70 kDa'dan büyük moleküllerin aljinattan difüzyona uğramadığını buldu. Bu nedenle, aljinatta hücre kültürü, matris biyosentezi ve ECM organizasyonunun düzenlenmesini incelemek için uygundur. Aljinatta kültürlenen hücrelerin mevcudiyeti, peptit düzenleyici faktörlerin ve farmakolojik ajanların transkripsiyonel, transkripsiyon sonrası ve translasyonel düzeylerdeki etkisini incelemeye olanak tanır.

Kondrositler ayrıca tip I ve II kolajen liflerinin bir matrisinde kültürlenir. S. Nehrer ve arkadaşları (1997), farklı tiplerde kolajen içeren gözenekli kolajen-proteoglikan polimer matrislerindeki köpek kondrositlerinin işlevlerini karşılaştırdı. Tip I ve II kolajen içeren kolajen matrislerinde kültürlenen kondrositlerin biyosentetik işlevinin morfolojisinde önemli farklılıklar buldular. Tip II kolajen matrisindeki hücreler küresel şekillerini korurken, tip I kolajende fibroblast benzeri bir morfolojiye sahiptiler. Dahası, tip II kolajen matrisinde kondrositler daha fazla miktarda glikozaminoglikan ürettiler. J. van Susante ve arkadaşları (1995), aljinat ve kolajen (tip I) jelinde kültürlenen kondrositlerin özelliklerini karşılaştırdı. Yazarlar, kolajen jelindeki hücre sayısında önemli bir artış buldular, ancak 6. kültür gününden itibaren hücreler karakteristik fenotiplerini kaybederek fibroblast benzeri hücrelere dönüştüler. Aljinat jelinde, hücre sayısında bir azalma gözlemlendi, ancak kondrositler normal fenotiplerini korudular. Kolajen jelinde, hücre başına proteoglikan sayısı aljinattan önemli ölçüde daha yüksekti, ancak jelde, kültürün 6. gününden itibaren matris elementlerinin sentezinde bir azalma gözlemlenirken, aljinatta sentez artmaya devam etti.

Katı üç boyutlu fibrin matrisi, içinde asılı duran kondrositleri farklılaşmış bir fenotipte destekleyen doğal bir maddedir. Üç boyutlu fibrin matrisi, kondrosit transplantasyonunda taşıyıcı olarak da kullanılabilir. Fibrinin avantajları, sitotoksisitenin olmaması, boşluğu doldurma yeteneği ve yapışkan kapasitesidir. Histolojik ve biyokimyasal çalışmalar, otoradyografi ve elektron mikroskobu, fibrin jelindeki kondrositlerin morfolojilerini koruduğunu, çoğaldığını ve 2 haftalık kültürden sonra bile matris ürettiğini göstermiştir. Bununla birlikte, G. Homminga ve ark. (1993), fibrin parçalanmasının 3 günlük kültürden sonra başladığını ve kondrosit dediferansiyasyonunun ilerlediğini bildirmiştir.

Yapay (sentetik) ECM'de kondrositlerin süspansiyonu

Rekonstrüktif veya ortopedik cerrahide kullanılacak kıkırdak implantları, izole kondrositlerin in vitro sentetik biyouyumlu bir matris içerisinde büyütülmesiyle elde edilebilir.

Poliglikolik asitte kültürlenen kondrositler çoğalır ve 8 hafta boyunca normal morfoloji ve fenotipi korur. Kondrosit-poliglikolik asit kompleksi hücrelerden, glikozaminoglikanlardan, kolajenlerden oluşur ve harici bir kolajen kapsülü vardır. Ancak bu tür implantlar iki tip kolajen molekülü içerir - I ve II. Bir dizi pasajla farklılaşmamış kondrositlerden elde edilen implantlar, birincil olarak farklılaşmamış kondrositlerden elde edilen implantlardan daha fazla miktarda glikozaminoglikan ve kolajene sahiptir.

L. Freed ve ark. (1993b), insan ve sığır kondrosit kültürlerinin lifli poliglikolik asit (FPGA) ve gözenekli polilaktik asit (PPLA) içindeki davranışlarını karşılaştırmıştır. Sığır kondrositlerinin FPGA veya PPLA içinde 6-8 haftalık kültürlenmesinden sonra, yazarlar hücre çoğalmasını ve kıkırdak matrisinin yenilenmesini gözlemlemiştir. FPGA'da, kondrositler küresel bir şekle sahipti ve kıkırdak matrisiyle çevrili lakunalarda yer alıyordu. 8 haftalık in vitro kültürlemeden sonra, yenilenen doku %50'ye kadar kuru madde içeriyordu (%4 hücre kütlesi, %15 glikozaminoglikanlar ve %31 kolajenler). PPLA'da, hücreler iğ şeklinde bir şekle ve az miktarda glikozaminoglikanlar ve kolajene sahipti. FPGA'da, hücre büyümesi PPLA'dan 2 kat daha yoğundu. Canlı organizmada, VPGK ve PPLC'de yetiştirilen kondrositler 1-6 ay içinde histolojik olarak kıkırdağa benzer doku üretti. İmplantlar glikozaminoglikanlar, tip I ve II kolajenler içeriyordu.

Sığır fetal kondrositleri gözenekli yüksek yoğunluklu hidrofobik ve hidrofilik polietilende kültürlendi. Her iki substratta 7 günlük inkübasyondan sonra hücreler küresel bir şekil korudu ve çoğunlukla tip II kolajen içeriyordu. 21 günlük kültürden sonra hidrofilik matrisin hidrofobik matristen daha fazla tip II kolajen içerdiği bulundu.

Kıkırdak dokusu ayrıca Millicell-CM filtrelerinde tek tabaka halinde kültüre alınarak da elde edilebilir. Kondroitinlerin bağlanması için filtrelerin kolajenle önceden kaplanması gerekir. Kültürün histolojik incelemesi, proteoglikanlar ve tip II kolajen içeren ECM'de kondrosit birikimini gösterir. Bu tür bir kültürde tip I kolajen tespit edilmemiştir. Elde edilen kıkırdak dokusundaki kondrositler küresel şekildedir, ancak doku yüzeyinde biraz yassıdırlar. Yeni oluşan dokunun kalınlığı zamanla artmış ve hücre tek tabakasının başlangıçtaki yoğunluğuna bağlı olmuştur. Optimum kültür koşulları altında, kıkırdak dokusunun kalınlığı 110 μm'ye ulaşmış, hücrelerinin ve kolajeninin yüzeysel ve derin katmanlara organizasyonu eklem kıkırdağına benzerdir. ECM yaklaşık 3 kat daha fazla kolajen ve proteoglikan içerir. 2 haftalık kültürden sonra, matris birikimi gözlemlenmiş ve bu da dokunun filtreden çıkarılmasına ve nakil için kullanılmasına olanak sağlamıştır.

Sims ve diğerleri (1996), enjeksiyon yoluyla çok sayıda hücrenin transferine izin veren kapsüllenmiş bir polimer matris olan polietilen oksit jelde kondrositlerin yetiştirilmesini inceledi. Atimik farelerin deri altı dokusuna enjeksiyondan altı hafta sonra, morfolojik olarak hiyalin kıkırdağa benzer beyaz bir opallik ile karakterize edilen yeni kıkırdak oluştu. Histolojik ve biyokimyasal veriler, ECM üreten aktif olarak çoğalan kondrositlerin varlığını gösterdi.

Açıklama

Kıkırdak dokusunun eksplantasyonu, içindeki ana- ve katabolizma süreçlerini, homeostazın korunmasını, rezorpsiyon ve onarımı incelemek için kullanılır. Kıkırdak eksplantlarındaki kondrositler, in vivo eklem kıkırdağındakine benzer normal bir fenotip ve ECM bileşimini korur. Serum varlığında 5 günlük kültürlemeden sonra, sabit bir sentez ve doğal bozunma süreçleri düzeyi elde edilir. Doku rezorpsiyonunun ana kültürde ve IL-IB, TNF-a, bakteriyel lipopolisakkaritler, retinoik asit türevleri veya aktif oksijen radikalleri gibi bir dizi ajan kullanılarak serum eklenerek kültürde hızlandırılması mümkündür. Kıkırdak onarımını incelemek için, hasarı çözünür inflamatuar mediatörler (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) veya matrisin fiziksel yırtılmasıyla indüklenir.

Organotipik kültür yöntemi, izole edilmiş dış faktörlerin kondrositler ve çevreleyen matris üzerindeki etkilerinin in vitro çalışmaları için bir modeldir. İn vivo olarak, kondrositler ECM'de seyrek olarak bulunur ve birbirleriyle temas etmezler. Eklem kıkırdağı eksplant kültürü, bu yapısal organizasyonu ve kondrositler ile çevreleyen hücre dışı ortam arasındaki spesifik etkileşimleri korur. Bu model ayrıca mekanik stresin, farmakolojik ajanların, büyüme faktörlerinin, sitokinlerin ve hormonların kıkırdak metabolizması üzerindeki etkilerini incelemek için de kullanılır.

Kıkırdak doku eksplantasyonunun bir diğer avantajı, hücrelerin izole edilmesi sırasında kaçınılmaz olan proteolitik enzimlerin veya mekanik faktörlerin etkisi altında kondrositlere zarar verilmemesidir. Reseptörler ve diğer membran proteinleri ve glikoproteinler hasar verici faktörlerden korunur.

[